非損傷微測(cè)技術(shù)測(cè)定液泡H+流速的方法

瀏覽次數(shù)：3175　發(fā)布日期：2011-10-19　來(lái)源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

液泡膜H⁺運(yùn)輸?shù)膫鹘y(tǒng)測(cè)定方法是通過(guò)pH熒光染料進(jìn)行體外檢測(cè)完成的。然而，該方法中高純度的液泡膜分離復(fù)雜，且對(duì)微弱的H⁺實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的靈敏度不夠，成為影響研究人員使用的原因。近年來(lái)，非損傷微測(cè)技術(shù)（NMT）已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于電生理研究中。NMT具有非損傷、高靈敏度和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)過(guò)程的優(yōu)點(diǎn)。迄今為止，雖然通過(guò)NMT已經(jīng)測(cè)定了甜菜液泡的Ca²⁺流，但還沒(méi)有對(duì)液泡H⁺流速的測(cè)定報(bào)道。因此，建立液泡以及細(xì)胞膜系統(tǒng)H⁺流速測(cè)定的方法，對(duì)研究質(zhì)子的運(yùn)動(dòng)和膜蛋白活性具有重要意義。

2011年，中科院植物所李銀心研究組對(duì)非損傷微測(cè)技術(shù)（NMT）測(cè)定液泡H⁺流進(jìn)行了方法上的若干修正，使得NMT可以更準(zhǔn)確地對(duì)液泡H⁺流進(jìn)行測(cè)定。同時(shí)，研究中使用新建立的體系測(cè)定NaCl應(yīng)激下轉(zhuǎn)基因煙草TS15和WT煙草的液泡H⁺流速差異，并用NMT方法測(cè)定液泡膜上H-ATPase和PPase的活性。研究首先根據(jù)NMT的可視化測(cè)定的特性，簡(jiǎn)化了液泡提取方法，省略了傳統(tǒng)檢測(cè)中繁瑣的超速離心的步驟。在200mM NaCl脅迫下，H⁺外流增加，但是TS15的H⁺外流要顯著強(qiáng)于WT的外流，說(shuō)明在轉(zhuǎn)基因植株中NHX1具有更高的活性。在200mM NaCl條件下施加ATP和PPi，液泡△H⁺流速的變化反映H-ATPase和PPase的活性大�。谎芯勘砻�，在施加ATP后，轉(zhuǎn)基因煙草液泡表現(xiàn)出更大的△H⁺流速；該結(jié)果說(shuō)明轉(zhuǎn)基因植株比WT植株在200mM NaCl條件具有更高的V-ATPase活性。同時(shí)，用傳統(tǒng)方法計(jì)算H-ATPase和PPase酶活結(jié)果也證實(shí)了NMT測(cè)定的準(zhǔn)確性。與傳統(tǒng)熒光方法相比，NMT從操作的流程，結(jié)果精度和結(jié)論的信息量上都具有更大優(yōu)勢(shì)。

本研究建立和修正了一種適合和精確的液泡H⁺流速的測(cè)定方法。用離子流差異還可以反映更多的生理特征，是一種可以替代傳統(tǒng)V-ATPase和PPase的活性測(cè)定方法的新手段。這種簡(jiǎn)單的方法將來(lái)能夠廣泛地進(jìn)行亞細(xì)胞和細(xì)胞器水平離子流速的檢測(cè)和分析。

參考文獻(xiàn)：Chen XY, et al. Analytical Biochemistry, 2011, 418: 295–297.

關(guān)鍵詞：非損傷微測(cè)技術(shù)，H⁺流速，SeNHX1，液泡

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