精制百日咳白喉破傷風疫苗之制造及鑒定

（日本社團法人北里研究所 生物制劑研究部 2006年）

1.精制無細胞百日咳疫苗原液
  將各項培養(yǎng)基成份預(yù)稱好倒入tank內(nèi)加水攪拌充分溶解后，將PH調(diào)至適當范圍，121℃滅菌。將滅菌后之培養(yǎng)基分瓶、接種Bordetella pertussis （strain Tohama Phase I）菌35℃培養(yǎng)。收集菌液（須進行pH、HA、FHA測試），用硫酸氨（Ammonium sulfate）沉淀，用高濃度鹽抽出，經(jīng)蔗糖梯度離心分離純化2次，第1次分離后進行HA測試、蛋白質(zhì)含量測試、免疫沉淀（FHA、PT），第2次分離后除上述三項測試外，加測LAL試驗。再加福爾馬林于35℃、5周不滅活處理后作為batch原液（須進行蛋白氮含量試驗、染色試驗、無菌試驗、滅活試驗、易熱性毒素否定試驗、小鼠體重減少試驗、小鼠白血球數(shù)增加試驗、Histamine增感試驗、熱原試驗）。
 
2.白喉類毒素原液
  將白喉桿菌接種于Loeffer Medium（斜面培養(yǎng)基），移種一次于Loeffer Medium，再移植至液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，然后用培養(yǎng)基增值、振蕩培養(yǎng)、接著大量接種培養(yǎng)于6支20公斤瓶中，其培養(yǎng)基在接種前加入無菌過濾之maltose。收集培養(yǎng)液，須進行染色試驗（確認無雜菌）及毒素力價Lf測定（此時約250Lf/Ml）。離心除菌，將毒素液無菌過濾、超濾（MW30,000）、用硫酸氨（Ammonium sulfate）沉淀、回收、限外超濾（MW100,000），再加福爾馬林于33-35℃、4-6周滅活處理（此時約500Lf/mL，須進行豚鼠及兔子之無毒化試驗）精制。過濾后作為batch原液（須進行純度試驗、內(nèi)毒素含量試驗、完全性試驗、Lf測定、無菌試驗、無毒化試驗（豚鼠及兔子）、小鼠體重減少試驗、白喉類毒素交叉否定試驗）。

3.破傷風類毒素原液
  將破傷風梭菌接種于培養(yǎng)基在35℃培養(yǎng)7天，收集培養(yǎng)液（須進行無菌試驗、染色試驗，確定無雜菌）、過濾（須進行Lf測定pH測定），過濾后膜作完整性試驗。限外過濾、用硫酸氨（Ammonium sulfate）沉淀精制、離心、通膠質(zhì)colum分離（分子量分離）過濾，此時須進行毒素力價Lf測定（約1,500~~2,000Lf/mL）。再加福馬林于35℃、5周滅活處理，作為破傷風類毒素原液（須進行純度試驗、Lf測定、蛋白氮含量試驗、無菌試驗、滅活試驗、小鼠體重減少試驗、破傷風類毒素交叉否定試驗）。

4.中間原液
  將精制百日咳疫苗原液、白喉類毒素原液、破傷風類毒素原液混合，以鋁凝膠吸附，作為中間原液。此時須進行pH試驗、鋁含量試驗、硫柳苯含量試驗、甲醛含量測驗、蛋白氮含量試驗、無菌試驗、異常毒性試驗、小鼠體重減少試驗。

5.最終原液
  將中間原液稀釋，作成最終原液。

6.小分制品
  將最終原液分裝充填而成，此時須進行pH試驗、鋁含量試驗、硫柳苯含量試驗、甲醛含量測驗、無菌試驗、異常毒性試驗、小鼠體重減少試驗、小鼠白血球數(shù)增加試驗、Histamine增感試驗、白喉類毒素無毒化試驗、破傷風類毒素無毒化試驗、效價試驗（吸附精制百日咳疫苗、吸附白喉類毒素、吸附破傷風類毒素）、蛋白氮含量試驗

7.國家鑒定