用日立特制的高速組織培養(yǎng)管分離細胞膜

 

一般的50 ml 培養(yǎng)管離心時允許使用的最高轉速都在12,000rpm 以下，Hitachi 在CR—G系列高速冷凍離心機中配置了新型的專用于組織培養(yǎng)管的轉頭R18A（18,000rpm，42,000xg，8×50ml TC管）并為此專門定制了高強度的50ml 錐底TC管。用這種轉頭分離細胞器，離心時間短，分離效果好。

 

設備：

Hitachi CR21G 或22G 高速離心機，R18A轉頭（可高溫消毒，121℃，20分），himac 50 ml TC管

 

分離步驟：

1．成年鼠肝勻漿4,000rpm（約2,000xg） 離心15分，4℃（R18A轉頭，8×50ml）

2．沉淀用1mM NaHCO₃ 稀釋再在4,000rpm離心15分，4℃

3．沉淀按濕重1g/ml NaHCO₃ 稀釋后配成68％蔗糖液，置于離心管下部，上部用42％蔗糖液

4．R18A轉頭，18,000rpm（42,200xg），4℃離心90分鐘，加速“5”減速“5”

5．離心后在42％與68％蔗糖液之間形成粗制細胞膜

6．粗制細胞膜吸出后用1mM NaHCO₃ 稀釋后再離心4,000rpm（近2,000xg）4℃離心30分，并重復此實驗二次

7．去除上清液沉淀再用1mM NaHCO₃ 稀釋，在50ml TC管中，從底部依次向上鋪設：68％蔗糖液（用稀釋的樣品配成）、48％蔗糖液、42％蔗糖液。

8．鋪好后再次離心，R18A轉頭，18,000rpm，4℃，90分鐘，加速“5”減速“5”

9．離心結束后可以看出細胞膜分布在42％與48％蔗糖液之間

 

討論：階梯形蔗糖梯度在50ml TC管中用高速離心機分離亞細胞構造（膜、線粒體、溶酶體、高爾基復合體、微體等）由于日立開發(fā)了高強度的組培養(yǎng)管而變得更為可行。以上只是一個例子，我們可以選擇不同的蔗糖階梯度來分離細胞器，可以得到相當高的純度。除了蔗糖梯度以外，用Percoll及Nycodenz 的自形成、予形成或階梯梯度分離亞細胞構造，近年來已被廣泛應用。