瑞沃德大成學(xué)堂之膜片鉗技術(shù)直播課完整回放上線

瀏覽次數(shù)：3749　發(fā)布日期：2022-8-25　來源：本站　本站原創(chuàng)，轉(zhuǎn)載請注明出處

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8月23日19：00，由瑞沃德主辦的最-新一期「大成學(xué)堂」直播課程活動如期開播。此次直播特邀南京大學(xué)張洋潯博士帶來“膜片鉗技術(shù)解析與經(jīng)驗分享”主題分享，傾囊相授膜片鉗技術(shù)的理論知識和操作常見問題。張洋潯博士細致入微的講解獲得觀眾們連連點贊！

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看點一
南大博士師兄超詳細講授膜片鉗技術(shù)

直播開始，張洋潯博士詳細介紹了膜片鉗技術(shù)的發(fā)展歷史及原理，緊接著以切身的實驗室工作經(jīng)驗來分享膜片鉗技術(shù)的整體系統(tǒng)組成及相應(yīng)的操作步驟，助力大家構(gòu)建對膜片鉗技術(shù)的整體認知體系并了解每個必要步驟的重要作用。其中在介紹顯微操作系統(tǒng)時評價“瑞沃德自主研發(fā)的顯微操作系統(tǒng)，非常好用，容易上手”。

在第二部分，張洋潯博士通過結(jié)合所在課題組之前的研究工作，進行了膜片鉗實驗的一些經(jīng)驗分享，其中包括“觀察宏膜電流，并研究某種代謝性受體的下游離子機制”、“quantal Excitatory Postsynaptic Currents(qEPSC)”等等。

在第三部分，張洋潯博士分享了各個實驗步驟的注意事項，例如“如何進行玻璃微電極拉制”、“如何避免堵電極”、“如何排除干擾”等，引起評論區(qū)熱烈地討論。其中張博士贊嘆“瑞沃德自主研發(fā)的微電極拉制儀，使用起來非常方便”。

看點二

40+膜片鉗實驗細節(jié)問題全解答

在答疑互動環(huán)節(jié)，觀眾們紛紛提出自己在實驗過程中遇到的問題，眾多提問迅速刷爆評論區(qū)：“達不到G歐封接時應(yīng)該排查哪些影響因素呢?”“單突觸和多突觸連接如何證明和區(qū)分呢？”“有哪些方法或操作可以避免記錄過程中細胞合上?”……足見膜片鉗技術(shù)在神經(jīng)科學(xué)研究中的重要地位和科研小伙伴們對膜片鉗技術(shù)不斷求知和鉆研的精神。張洋潯博士也不遺余力地為大家進行了解答，不僅在直播中在線解答了近20個問題，還在直播后，對其他未回答的問題進行了整理和文字回復(fù)。咱就是說，是不是超用心~

聊天區(qū)問題詳解（文字版）

1、成像系統(tǒng)是用一般的顯微鏡嗎？放大倍數(shù)是多少？
答：顯微鏡就是普通的正置顯微鏡，有些型號的顯微鏡自帶放大一倍的功能。我們使用的低倍鏡是5倍鏡，高倍鏡是40倍鏡，常用鏡頭即可。此外不同的Camera和軟件對圖像處理的能力也不太一樣，會影響視覺效果。

2、電流鉗模式下如何維持膜電位穩(wěn)定，可以分享一下經(jīng)驗嗎？
答：這個一般狀態(tài)比較好的細胞，它在電流鉗模式下記錄到的基線會很穩(wěn)定，一些前期波動是因為電極內(nèi)液交換所致，是正常的。如果該腦區(qū)存在自發(fā)放電，一般都能夠記錄到；有時候也有規(guī)律性的EPSP或IPSP，這也是正常的。如果你發(fā)現(xiàn)膜電位一直在動，并且從負值跑到0或者正值，可能就是細胞狀態(tài)不對了，這也是一個正常的現(xiàn)象，沒有什么好的辦法可以操作；如果所有細胞都有這種現(xiàn)象，需考慮一下是否是電極內(nèi)液有問題。此外，如果是一種周期性的浮動，考慮一下要把液面調(diào)穩(wěn)，可能原因是出水口和進水口的壓力不一致，使得液面波動，換管子或者清理管子都能解決。此外，如果膜電位浮動一些值能到穩(wěn)定狀態(tài)，可以用注射正或負電流方式，將細胞穩(wěn)定在你一直進行實驗的膜電位上，因為這也是文獻描述的一種方法。

3、請問一般細胞的封接時間可以維持多久，如達不到常見維持時間可能有哪些影響因素呢？
答：如果是吉歐封接，一般成功后，稍過一會兒撤回正壓，基本不會掉。當然得注意不能一直給負壓，那會將細胞一直吸入電極里面，影響記錄；如果是正常一個細胞能進行多久實驗的話，其實狀態(tài)非常好的細胞，包括各項設(shè)備和操作都正常，能記錄不止2個小時。我曾經(jīng)也請教師兄師姐，包括我自己也體會，就是遇到的那種狀態(tài)特別好的細胞，印象非常深刻的細胞也就那么幾個，當然它們的數(shù)據(jù)也都在文章中的raw data示例圖里面；那其實我們能做的就是增加patch的次數(shù)，或者把關(guān)鍵實驗提到細胞狀態(tài)較好的前期來進行，因為細胞狀態(tài)由好到不好，是一個客觀存在的現(xiàn)象。

4、感覺腦片細胞破膜比培養(yǎng)細胞困難，有什么操作訣竅嗎？
答：我本身使用的是用嘴吸的方法破膜，如果你用的是注射器破膜可以考慮嘗試一下。就用1 ml注射器的外殼，嘴對著后面吸。但其實我覺得只要熟練操作，應(yīng)該就沒什么問題，但需要練習(xí)。兩種細胞我都patch過，我覺得都沒什么很離譜的阻止破膜的因素。另外如果是因為吉歐封接不正常所導(dǎo)致的吸破不成功，這也是正常的，還是需要吉歐封接的成功。此外玻璃微電極的口徑很小的話，也會影響破膜，考慮用電阻3-5 MΩ的。

5、為了避免記錄過程中細胞合上（串聯(lián)電阻變大）破膜時或破膜后需要注意啥，或者有哪些特殊操作？
答：這個其實避免不了，咱們能做的就是長期監(jiān)測膜電容電流的形狀，如果變得矮胖了，Ra值變大了，我們就輕輕吸。當然有時候會把細胞吸掉，這也不用灰心，總之多做就能熟能生巧。從另一方面來說，關(guān)鍵實驗還是得快點做，因為越往后面越難吸。

6、面對基線不穩(wěn)。常見的原因有哪些？（記錄電極充分鍍氯，使用的也是商業(yè)化的參考電極）答：第一可能是液面波動較大所致，如果將記錄模式放到I = 0模式，電極入水，觀察一下記錄信號是否是有一定周期性變化。這個時候就需要考慮將水流和液面調(diào)穩(wěn)。第二，在patch完細胞以后，因為內(nèi)液交換，導(dǎo)致基線變化是正常的，可以等穩(wěn)定再進行實驗，一般5 min左右可以完成。如果基線在長期一直變化（比如高于10 min），得考慮細胞狀態(tài)的原因?qū)е�，這個時候不能猶豫，趕緊換下一個細胞。當然基線變化在小范圍內(nèi)，其實都可以接受的。

7、如何判斷steady state呢？
答：上述一些問題問了細胞基線不穩(wěn)定的狀態(tài)下怎么去調(diào)回穩(wěn)定狀態(tài)。如果是指機器穩(wěn)定狀態(tài)的話，我覺得就是沒有非常異常的干擾信號被你所記錄下來。如果有異�；蛘呓涣鳂幼兓碾娦盘�，就需要排干擾；如果是指細胞穩(wěn)定狀態(tài)，就得看whole-cell recording狀態(tài)下，這個基線有沒有異常的波動。一般吸破細胞，由于內(nèi)液交換，會使得基線變化，但是會穩(wěn)定在一個值上；除此之外的基線波動，需要看看會不會對你記錄的電信號造成直接影響，再按照推理的方式進行排除。細胞狀態(tài)由好變?yōu)椴缓�，其實也都屬于正常的，我們需要多patch，才能做完一個實驗。

8、電極拉制后需要再處理電極嗎，例如酒精浸泡、超聲清洗之類的？
答：其實是很必要的。酒精浸泡、超聲清洗應(yīng)該發(fā)生在拉制電極之前，對所有的毛細玻璃管進行該操作。之后拉制完電極，需要拋光這個操作，讓尖端更光滑，更易封接。如果有設(shè)備的話，可以進行拋光操作；如果沒有的話，使用直接拉出來的玻璃微電極也可以。如果你買來的玻璃微電極拆開后非常干凈，其實就可以直接使用，之后要橫向保存在一個密閉環(huán)境，減少灰塵影響。長期暴露的這種玻璃毛細管，就需要酒精浸泡、超聲清洗這些步驟。

9、每次換加熱片后拉制參數(shù)都要重新調(diào)試一遍嗎？
答：是的，都得跑一次ramp test或者軟化點測試（瑞沃德公司拉制儀），看看這個溫度點和你之前參數(shù)設(shè)置的大不大，不大的話就可以繼續(xù)使用原參數(shù)拉一根電極，看看口徑變化大不大。如果變化不大，可以依然使用原參數(shù)；如果變化很大，就得用測得的這個軟化點或者ramp test溫度來重調(diào)參數(shù)。

10、ACSF用前必須要校正pH嗎？
答：ACSF里面其實含有緩沖系統(tǒng)，外源性添加的東西一般不會影響整體。文獻中都說pH 維持在7.2 ~ 7.4，只要照著他們給的配方配制，用正常純水或者雙蒸水，不太會出問題。如果你們是用母液保存，使用的時候稀釋的方式進行ACSF配制，這就需要對母液pH進行調(diào)節(jié)，然后對稀釋后的ACSF進行pH評估，看pH會不會受到影響，心里得有個數(shù)。我使用的ACSF是現(xiàn)配現(xiàn)用，之前用pH計測過一次，其實在7.2左右，后面也就沒再測。只要實驗條件不變，一般不會造成pH很大影響。

11、成年鼠取腦片不灌流影響很大嗎？
答：其實非常大。① 因為有血的話，本身會對你的腦片透光性造成影響；② 其實并不是說，不灌流就會導(dǎo)致patch不上細胞，不灌流可能會導(dǎo)致你切出來的腦片死的速率加快；你可能前幾張腦片能patch細胞，并也能記錄，但是后面腦片狀態(tài)容易很快變得不好。此外，細胞的活力本身也會受到影響，容易狀態(tài)不好。我之前遇到過的就是沒灌流好，結(jié)果在我那個腦區(qū)就看不見細胞。這里可以推薦你去jove上搜索patch clamp成年腦片制備相關(guān)的資料，他們做了對比，并且也描述目的是減少腦片受到缺氧的影響。

12、我們實驗時發(fā)現(xiàn)微操的操作柄會引入很大的噪聲，不知道老師有沒有相應(yīng)的建議呢？
答：看看干擾是不是交流電，是的話就考慮用使用接地的方式，將其和這個膜片鉗防震臺一起接地，并且用錫紙給它包一層，看看能不能解決。如果是使用過程中會有相關(guān)的電流信號產(chǎn)生，就看看能不能用減少摩擦的方式。此外，還可以嘗試通過調(diào)low pass 或high pass看看能不能濾去這個噪聲。

13、請問老師patch浦肯野細胞對于比較深的細胞您會去做嗎？我感覺正壓不能很好的吹干凈細胞表面。我的切片厚度是250um。做太深的細胞電極很容易堵。還有您在封接浦肯野細胞的時候holding是一步到位嗎？
答：我做的是成年浦肯野細胞，并且矢狀切，因為冠狀切不太容易區(qū)分相應(yīng)分區(qū)，而且我個人覺得得到的浦肯野細胞層不規(guī)則，影響視覺效果。此外，我patch過表面的和它后面一層的浦肯野細胞，因為胞體巨大，下電極一般不能再把深層的浦肯野細胞暴露得很清楚。250 μm切片可以的，電極堵住可能并不是因為下的深，是因為正壓太大把臟東西吹出來了，應(yīng)該注意電極內(nèi)液污染的事項。封接浦肯野細胞需要慢慢的holding，我這邊從0 mV開始，按照Δ -10 mV的變化直到鉗制目的電位，在每個電位變化下穩(wěn)定幾秒就行。我在封接時，用普通鉀離子內(nèi)液的確很難瞬間吉歐封接，需要耐心等一會兒。

14、小白一枚，請問有沒有推薦的入門書籍呢？
答：推薦劉振偉老師的《實用膜片鉗技術(shù)》；陳軍編的《膜片鉗實驗技術(shù)》。書中所描述的許多偏向物理，可以選自己能理解或者需要了解的去閱讀。另外有機會的話，還得去相關(guān)實驗室去學(xué)習(xí)，手把手教學(xué)我個人還是覺得挺必須的。

15、請問我的細胞破膜后IV刺激總掉或者不易破膜，是什么情況？
答：如果電流刺激或者電位變化過大，的確會造成細胞狀態(tài)不好。但是重要的實驗還是得多做，總有穩(wěn)定的細胞被patch并被記錄到。有時候一個細胞就跑一個protocol的實驗也可以，并不需要每個細胞都把所有實驗的protocol都跑完。不破膜可能就是玻璃微電極電阻過大，口徑小。這種電極易于封接但不易吸破，考慮換口徑大一點，又和你目標細胞相對合適的玻璃微電極進行patch。

16、請問記錄sIPSc時有的使用普通K內(nèi)液，鉗制0mvundefined 看文獻中類似的腦區(qū)細胞，有的用含Cs內(nèi)液-QX314，也是鉗制0mv ，會影響記錄結(jié)果嗎？
答：在記錄sIPSC時，如果鉗制在0 mV，用的內(nèi)液鉀成分是K-methylsulfate （140 mM）。如果鉗制在靜息電位下，用的可以是K+內(nèi)液，但是成分為KCl （135 mM），同時也是高氯的，一般老文獻會用這種配方；另外就是CsCl（110 mM）內(nèi)液加QX 314來阻斷動作電位和K+通道。一般情況下建議，對于同一個課題內(nèi)的實驗，不要改變內(nèi)液的種類；更不能改變鉗制方法，因為兩種鉗制方法下的電化學(xué)梯度力不會完全一樣。

17、請問原代神經(jīng)元為什么老是測不到誘發(fā)動作電位？
答：我本身沒做過相關(guān)實驗，但是我猜測原因可能是：①取原代神經(jīng)元應(yīng)該在鼠幼年未發(fā)育階段，這個時候本身細胞的電活動就不會太強。我個人在幼鼠腦片上也不會很容易記錄到AP，基本上在成年動物上才能穩(wěn)定記錄到；②你做的是原代細胞，也不是幼鼠的急性腦片，這就會導(dǎo)致細胞周圍的環(huán)境勢必受到影響，也是不可忽視的因素。這個難度還是肯定有的，需要看看文獻的方法，借鑒別人用了什么特殊的內(nèi)液或外液。

18、請問怎么確定自己吸住的是自己想要的單個通道呢？能介紹一下單通道記錄的經(jīng)驗嗎?
答：我沒有做單個通道的實驗。看別人文獻如果在腦組織細胞中分離某種通道的電流，也是在whole-cell recording下，用其他通道的阻斷劑以及可以激活該通道的電位protocol來分離該種通道的宏膜電流。在歷史上做單個通道實驗的時候，的確會有你提的這個問題，解決方式可參考以下，在爪蟾卵母細胞上僅表達你目標通道的基因，這樣你patch的膜上就僅有你這個通道蛋白，不會有別的通道；還有一種用人工的方法將離子通道和人造的脂雙層混合，形成脂質(zhì)體進行實驗。

19、請問膜片鉗注入的反向電流與平衡的電流時差有多少？注入的電流會否對細胞內(nèi)部離子的改變，影響后續(xù)的電生理記錄？
答：這個時差可以忽略不計的，假設(shè)你一次記錄有多個突觸傳遞信號，這些信號都和實際存在時差，所以相對而言這些突觸傳遞信號本質(zhì)是連續(xù)的。電壓鉗模式下，注入電流的目的是為了抵消某個鉗制電壓下的跨膜電流，所以對于細胞來說，它胞內(nèi)和胞外的電荷沒變；Ag/AgCl電極以及電極內(nèi)液勢必會改變胞內(nèi)離子成分，這是客觀存在的，但對你記錄到的電信號來說不會有任何影響。但需要知道電壓鉗狀態(tài)下的細胞已經(jīng)不是生理情況下的狀態(tài)，因為它的膜電位被鉗制住，不會再變化了。

20、分析曲線各種數(shù)據(jù)處理用什么軟件比較好呢？
答：平常還是用的Clampfit。對于突觸傳遞事件，我?guī)熜趾蛶熃阃扑]用mini analysis。

21、請問老師做場電位嗎，想請教一下可以刺激出EPSP，但是誘導(dǎo)不出LTP是為什么呢？
答：能記錄到fEPSP就說明整個系統(tǒng)沒什么問題。誘發(fā)不出LTP來的原因可能是細胞狀態(tài)不太好。具體的話可以考慮這幾個方面：① ACSF通氧需要很充足；②電刺激調(diào)小一點，因為長期記錄時，每20 s或30 s就要給一次電刺激，過大可能會導(dǎo)致突觸前遞質(zhì)消耗大于補充，可以參考文獻確定用多大的電刺激。此外LTP實驗還是得多做，找到LTP表型明確的細胞。如果是別的沒有報道的腦區(qū)，LTP誘發(fā)實驗可能更難誘發(fā)出來，但如果別人報道有，還是得增加信心一定能做出來。

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